【摘 要】 目的  观察灯盏花素（BRE）对佐剂性关节炎大鼠的治疗作用及其对滑膜基质金属蛋白酶-3（MMP-3）、金属蛋白酶组织抑制物-1（TIMP-1）表达的影响。 方法  将50只雄性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、BRE组、来氟米特（LEF）组和联合用药（BRE+LEF）组，采用弗氏完全佐剂造模，观察治疗前后各组大鼠的足爪容积及关节炎指数;免疫组织化学方法检测MMP-3、TIMP-1在关节滑膜组织中的表达。 结果  与治疗前比较，BRE组、LEF组及BRE+LEF组治疗后大鼠的足爪容积及关节炎指数显著降低（P<0.05），联合用药组的效果更明显（P<0.01）;与模型组比较，各用药组的MMP-3表达显著减少（P<0.05），TIMP-1表达均有所增加（P<0.05），联合用药组较单一用药组效果更明显（P<0.05）。 结论  BRE对大鼠佐剂性关节炎具有显著治疗作用，并可下调滑膜MMP-3表达、上调TIMP-1表达;BRE与LEF联合应用具有增效作用，为临床应用活血化瘀药联合治疗RA提供了实验依据。
    
　　【关键词】  关节炎，实验性;金属蛋白酶类;金属蛋白酶类组织抑制剂;滑膜;灯盏花素;来氟米特;疾病模型，动物
         
　　The effect of breviscapine on MMP-3，TIMP-1in synovial tissue on the adjuvant arthritis rat

　　LI Zhenbin，DUAN Junhong，SHAHaijing，et al.

　　Bethune International Peace Hospital，Shijiazhuang050082
   
　　【Abstract】 Objective To observe the curative effects of breviscapine（BRE）on the adjuvant arthritis（AA）rat and explore the influence of BRE on MMP-3，TIMP-1.Methods Fifty male Wistar rats were randomly divided into5groups:normal group、model group，LEF group，BRE group，combination of LEF and BRE group.Experiment AA rat mod-els were established by Freund's adjuvant Complete.Paw volume，arthritic index and general status were detected.And the expression of MMP-3，TIMP-1in synovial tissue of joint were observed by immunohistochemistry before and after treat-ment.Results LEF group，BRE group，combination of LEF and BRE group could markedly reduce the degree of rat pedal swelling and arthritic index compared with those before treatment（P<0.05）.The effect of combined of LEF and BRE group was superior to the LEF group or BRE group（P<0.05）.The expression of MMP-3on each treated groups were markedly reduced as compare to that in the model group（P<0.05）;And the expression of TIMP-1in each treated group was increased（P<0.05）.The effect of combined of LEF and BRE group was better than BRE group or LEF group.Conclusion BRE、LEF、BRE+LEF can reduce the pawvolume and arthritic index，decrease effectively the expres-sion of MMP-3and increase the expression of TIMP-1in synovial tissue of joint.They can significantly inhibit the sec-
ondary arthritis of AA rat.The effect of combined group is superior to BRE or LEF.
   
　　【Key words】 Breviscapine;Leflunomide;Adjuvant arthritis;Matrix metalloproteinase-3;Tissue inhibitor of metal-loproteinase-1    
      
　　类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是临床最常见的炎性关节病和主要致残因素之一［1］ 。其主要病理特点是滑膜细胞增生、衬里层增厚、多种炎性细胞浸润、血管翳形成，以及软骨和骨组织的破坏。近年研究表明［2］ ，RA软骨和骨破坏的分子基础是细胞外基质成分降解失衡，其中基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）起着重要的作用。近年来，我们在临床上应用灯盏花素联合来氟米特治疗RA取得了较好疗效［3］ 。为了进一步探讨其作用机制，我们观察了灯盏花素对佐剂性关节炎大鼠的治疗效果及其对滑膜MMP-3及金属蛋白酶组织抑制物-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）表达的影响。现将研究结果报告如下。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 动物 雄性Wistar大鼠，体重（180±20）g，由河北省实验动物中心提供，实验动物合格证编号:DK0509020。

    1.2 药品、试剂与仪器 来氟米特粉，由万岁药业惠赠。灯盏花素注射液，哈尔滨三联药业有限公司生产。卡介苗（50mg.支），上海生物制品研究所生产。羊毛脂，中国华亭羊毛脂厂生产。轻质液体石蜡，江西德成制药有限公司生产。MMP-3、TIMP-1、SAP试剂盒由北京中山生物技术公司提供。容积测量仪，自制。Olympus BX50型显微镜、Olympus BX20型显微照相设备，日本奥林巴斯光学工业株式会社生产。

　　1.3 实验方法

    1.3.1 造模及给药方法 将液体石蜡和羊毛脂（2∶1）共热至70℃下振摇，高压灭菌，然后每mL加入卡介苗7.5mg充分研磨混合均匀，制成Freund's完全佐剂。将50只大鼠随机分为5组:正常组、模型组、灯盏花素（BRE）组、来氟米特（LEF）组和联合用药（BRE+LEF）组，每组10只。除正常组外，在每鼠右后足跖皮内注射Freund's完全佐剂0.01mL致炎［3］ ，复制佐剂性关节炎（AA）模型。于致炎后第19日开始给药，来氟米特组来氟米特20mg.（kg??d），灌胃给药;灯盏花素组灯盏花素50mg.（kg??d），尾静脉注射给药，联合用药组灌胃给予来氟米特20mg.（kg??d），尾静脉注射给予灯盏花素50mg.（kg??d）;正常组及模型组予0.9%氯化钠注射液灌胃，1mL.100g，每日1次。各组疗程均为14日。
   
　　1.3.2 观察项目及检测方法

    1.3.2.1 足爪容积的测定 根据排水法原理测量大鼠足爪容积（mL）。

    1.3.2.2 关节炎指数（AI）的计算 致炎后第12日开始观察并记录全身关节病变程度，每3日1次。全身病变按5级评分法评价，根据未注射佐剂的其余3只肢体的病变程度累积计分，计算出指数［4］ 。标准如下:0分:无红肿;1分:小趾关节红肿;2分:趾关节和足跖肿胀;3分:踝关节以下的足爪肿胀;4分:包括踝关节在内的全部足爪肿胀。累计各关节的积分，即为该大鼠的关节炎指数。

    1.3.2.3 MMP-3、TIMP-1免疫组织化学检测 取动物踝关节滑膜组织，经Boin′s液固定1周后，组织脱水，常规石蜡包埋、切片。免疫组化染色，观察滑膜中MMP-3、TIMP-1的表达情况，采用SP方法:①石蜡切片脱蜡和清水冲洗后，微波加热10min，保温10min，磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）冲洗5min;②加50μL的非免疫性动物血清，室温下孵育10min，PBS冲洗5min;③加50μL的第1抗体，室温下孵育1～2h，PBS冲洗5min;④加50μL的生物素标记的第2抗体（通用型），室温下孵育10min，PBS冲洗5min;⑤加50μL的碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，室温下孵育10min，PBS冲洗5min;⑥二氨基联苯胺 （DAB）染色1～5s（显微镜下控制），苏木素复染5s;⑦脱水、透明、封片。用HPIAS-1000图像分析系统进行检测。随机检测5个高倍视野（×400），计算每个视野的阳性面积比，取其平均值。阳性面积比为每个视野阳性面积占整个视野面积的百分率，以其作为阳性反应细胞密度（简称阳性密度）。
   
　　1.4 统计学方法 所有数据以均数±标准差（ˉx±s）表示，应用SPSS10.0软件做统计分析。组间比较采用方差分析，P<0.05为有统计学意义。

　　2 结 果
    
　　2.1 各组对AA大鼠关节炎指数及左足爪容积的影响 见表1、2。
     
　　表1 各组对AA大鼠的关节炎指数的影响  略
         
　　表2 各组对AA大鼠的左足爪容积的影响  略
        
　　由表1、2可见，造模后18日各组大鼠的足爪容积及关节炎指数差异无统计学意义（P>0.05）;给药后1周、2周3个给药组大鼠的足爪容积和关节炎指数较模型组显著下降（P<0.05）;联合用药组与单一用药组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。
   
　　2.2 各组对AA大鼠滑膜组织MMP-3、TIMP-1表达的影响 见表3。
   
　　表3 各组对AA大鼠滑膜组织中MMP-3、TIMP-1表达的影响  略
    
　　由表3可见，正常组大鼠的滑膜组织中仅见少量的MMP-3阳性细胞表达，模型组大鼠滑膜细胞层及滑膜下层的MMP-3阳性密度明显高于正常对照组，两者比较差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，各用药组的MMP-3表达显著减少（P<0.05，P<0.01），联合用药组与单一用药组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

    模型组大鼠滑膜组织TIMP-1的表达阳性密度与正常组比较明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）;各用药组的TIMP-1表达阳性密度均明显高于模型组（P<0.05）;联合用药组与单一用药组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

　　3 讨 论
    
　　RA的主要病理学特征是滑膜细胞高度增生并伴有大量淋巴细胞浸润形成血管翳，血管翳向邻近软骨和骨组织侵袭，导致软骨和骨的破坏。软骨细胞依赖生存的细胞外基质降解异常是导致软骨病变的重要原因。MMPs是一类广泛存在于各种结缔组织中，在细胞外基质的生理和病理性降解过程中起重要作用的蛋白酶超家族。根据其作用底物的不同，分为胶原酶、基质溶解素、明胶酶。目前研究较多的是MMP-3，又称间质溶解素（stromelysin），其功能除了能降解胶原，还能降解基底膜成分，广泛存在于多种组织及细胞中，其独特的功能是能激活其它种类的MMPs［5］ 。TIMP-1是MMP的特异性抑制剂，在细胞外基质代谢调节中，是与MMP对应的负调节剂，对MMP-3有特异性。在正常情况下，TIMP-1与MMP-3之间存在着一精细的平衡。但在RA，由于白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子的作用，使这种平衡移向金属蛋白酶，导致软骨基质的降解。

    RA属于中医学痹证范畴，早在《内经》时期即有瘀血致痹的认识。《杂病源流犀烛??诸痹源流》曰:“痹者，闭也，三气杂至，壅闭经络，血气不行，不能随时祛散，故久而为痹。”说明气血运行不畅是痹证的重要病理环节。灯盏花素是从菊科飞蓬植物灯盏花（灯盏细辛）中提取出来的有效成分，主要是灯盏乙素，结构式为4，5，6-三羟基黄酮-7-葡聚糖醛酸甙。研究证明［6］ ，灯盏花素有减少血小板计数、抑制血小板聚集、抑制内凝血及促进纤溶活性的作用，可以改善微循环障碍及降低血液黏滞度。近年研究表明，RA患者的血小板计数的变化与IL-1呈直线正相关［7］ ;灯盏花联合来氟米特可明显降低活动性RA患者外周血白细胞介素-1β（IL-1β）和TNF-α表达［3］ 。本实验结果显示，灯盏花素可有效抑制佐剂性关节炎大鼠的继发病变;减少滑膜组织中MMP-3的表达，同时增加TIMP-1的表达。推测其可能通过活血化瘀作用，降低血小板水平，抑制IL-1的分泌，从而减少MMP-3的产生，调节MMP-3.TIMP-1的失衡。
   
　　来氟米特（LEF）是异恶唑的衍生物，对细胞免疫和体液免疫均有抑制作用。口服吸收后在肝脏和肠壁内迅速转化为活性代谢产物A1771726，其通过抑制二氢乳清酸脱 氢酶（DHODH）的活性从而阻断嘧啶的从头合成途径，使增生活跃的T、B淋巴细胞等受到抑制，减少免疫球蛋白的产生，阻止IL-1、白细胞介素-6（IL-6）、TNF-α的释放，抑制免疫性炎症反应［8］ 。A771726还可引起核转录因子-κB（NF-κB）的活化、从而抑制NF-κB对多种细胞因子（如IL-1、TNF-α等）的基因调控、抑制B细胞增殖和抗体的产生，抑制金属蛋白酶的表达，阻止关节炎患者的骨关节损伤。
   
　　本实验结果显示，BRE联合LEF对佐剂性关节炎的治疗作用明显优于单一用药组，二者联合能更有效地调节MMP-3.TIMP-1的失衡，抑制RA的软骨和骨破坏，为临床上更广泛地应用活血化瘀药联合LEF治疗RA提供了实验依据。

    关于BRE与LEF联合应用的增效机制，推测与BRE的活血化瘀作用改善LEF有效成分A771726在体内的循环及吸收、代谢、排泄等过程或4，5，6-三羟基黄酮-7-葡聚糖醛酸甙与A771726在体内代谢过程中产生了新的物质等有关，尚有待进一步深入研究。
    
　　参考文献
    
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　　中国人民解放军白求恩国际和平医院风湿免疫科，河北石家庄 050082