【摘 要】 目的  探讨中药冬虫夏草（cordyceps sinensis，CS）对人乳癌细胞株MCF-7体外增殖抑制作用及凋亡的影响。 方法  应用MTT比色法测定CS对MCF-7的增殖抑制率;应用流式细胞仪、DNA琼脂糖凝胶电泳法观察细胞凋亡。 结果  CS能抑制MCF-7细胞生长，且呈浓度.时间依赖性，CS在1.0～50μg.mL培养24～96h生长抑制率改变最为明显;CS可使MCF-7细胞凋亡，流式细胞仪DNA直方图上出现了凋亡峰，凋亡率分别为（4.9±3.2）%、（10.7±2.7）%、（14.7±0.5）%，对照组凋亡率为（0.9±0.2）%，凋亡率呈浓度依赖性;琼脂糖凝胶电泳可见DNA梯形条带。 结论  CS可诱导MCF-7细胞凋亡，对MCF-7细胞具有增殖抑制作用。
    
　　【关键词】  冬虫夏草;乳腺肿瘤;细胞增殖;细胞凋亡
         
　　Induction of apoptosis in human breast cancer cell line MCF-7by CS

　　LIUDongying.

　　Department ofWestern Medicine combined withTraditional ChineseMedicine，Tianjin Cancer Hospital Affiliated to Tianjin Medical University，Tianjin300060
   
　　【Abstract】 Objective To investigate effects of cordyceps sinensis（CS）on proliferation and apoptosis of breast cancer cell line MCF-7.Methods MTT assaywas used to measured the anti-proliferative effects of CS.Cell apoptosis was analyzed by flow cytometry（FCM）and agarose gel electrophoresis.Results CS could inhibit the growth of MCF-7cells in a dose.time dependent manner.The anti-proliferative effect was more obvious from1.0μg.mL to50μg.mL during24～96h.MCF-7cells appeared notable apoptosis after incubation of10μg.mL，20μg.mL，50μg.mL CS for48h.An apop-totic peak appeared in DNA histogram of FCM，apoptotic rate of MCF-7cells were（4.9±3.2）%、（10.7±2.7）%and（14.7±0.5）%，respectively.The apoptotic rate of cells was dose dependent，too.After treatment of20ug.mL and50μg.mL of CS for48h，a fragmented DNA ladder was observed by agarose gel electrophresis.Conclusion CS may induce ap-optosis，and inhibit proliferation of MCF-7cells.
   
　　【Key words】 Cordyceps sinensis（CS）;Breast cancer;Cell proliferation;Cell apoptosis
           
　　冬虫夏草（cordyceps sinensis，CS）是我国的传统中药，与人参、鹿茸齐名，并誉为中国的三大补药。产于我国青海、云南、四川、西藏等地3000～5000m高原地区，其僵虫部分名“虫”，头部生长的子座为“草”，故名冬虫夏草。该药性甘温，归肺、肾经，有补肾填精、滋阴益气之功。临床及实验研究表明，CS具有较好的抗肿瘤作用，能防治肿瘤患者放化疗的毒副作用及调节人体细胞免疫功能［1］ 。还可以明显抑制小鼠Lewis肺癌原发灶生长和自发肺部转移，其作用机制是促进小鼠脾淋巴细胞转化率，激活腹腔巨噬细胞吞噬活性［2］ 。刘凤安等［3］ 用人喉癌细胞株Hep-2体外细胞培养法证实，冬虫夏草水提物对喉癌细胞的增殖性生长有直接抑制作用。本研究通过观察冬虫夏草对乳癌细胞株MCF-7的增殖抑制及诱导凋亡的作用，进一步丰富冬虫夏草治疗乳腺癌的的现代理论依据。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 材料 人乳癌细胞株MCF-7由天津肿瘤医院中心实验室提供。冬虫夏草发酵液浓缩液（79mL，98.3g，折光率47.7%）由天津市微生物研究所提供。RPMI1640培养液（Gibco）、胎牛血清、0.25%胰酶（Trypsin）（Hyclone）、四甲基偶氮唑盐（MTT）（Fluka）、滤芯（0.22μm，MilliPORE）、E.Z.N.A.Blood DNA Kits（D3492-01）（Omega Bio-tek，美国）、冷冻干燥机（Thermo life science，美国）、酶标仪（TE-CAN，奥地利）、流式细胞仪（Coulter Epics-XL）、紫外检测仪（Eppendorf）、奥林巴斯（Olympus）倒置显微镜，均由天津肿瘤医院中心实验室提供。

    1.2 药物制备 冬虫夏草发酵液的浓缩液为棕黄色黏稠液体，溶解于RPMI1640培养液20mL中，配制成终浓度为20mg.mL试验用液，用0.22μm滤器过滤除菌，置无菌瓶中，4℃冰箱保存备用。

    1.3 细胞培养 人乳癌细胞株MCF-7置于含10%胎牛血清、100IU.mL青霉素和100μg.mL链霉素的RPMI1640培养液，37℃，5%CO2 培养箱中培养。

    1.4 MTT比色法检测药物对MCF-7细胞的增殖抑制作用 取对数生长期的细胞进行常规消化，调整细胞浓度至3×104 .mL，100μL.孔接种到96孔板。培养24h后实验组加入CS，浓度分别为:0.1、1.0、10、20、50、100μg.mL，每个浓度设4个平行孔，100μL.孔。对照组加入培养液，100μL.孔，设8个平行孔，分别继续培养24、48、72、96、120h。2组均加入以无血清RPMI1640培养基溶解的MTT（5mg.mL），20μL.孔，继续孵育4h后弃去上清，加二甲基亚砜（DMSO）150μL.孔，室温摇动30min。酶标仪测定570nm处的吸光度（A）值并记录结果。按以下公式计算抑制率:活性抑制率=（对照组A值-实验组A值）.对照组A值×100%。

　　1.5 流式细胞仪分析细胞周期和凋亡细胞百分率（凋亡率） 取对数生长期细胞，常规消化，调整细胞浓度至5×105 .mL，接种到培养瓶中，4mL.瓶，24h后加药。实验组:10、20、50μg.mL，4mL.瓶;对照组加入培养液4mL.瓶。培养48h，常规消化、离心，收集药物作用后的细胞。2组均用磷酸盐（PBS）缓冲液洗2次，200μL PBS重悬，滴加在4℃预冷的95%乙醇中，4℃冰箱固定过夜（18h以上）。重新震荡摇匀后，离心弃掉乙醇，PBS缓冲液洗1次，加入500μL碘化丙啶（PI）（50μg.mL），4℃避光染色30min，用200目尼龙网过滤移至流式管中，上机检测。

    1.6 凋亡细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳 收集20、50μg.mL CS作用48h后的细胞和对照组细胞，用E.Z.N.A.Blood DNA Kits（D3492-01）提取细胞DNA。紫外分光光度计测定DNA含量及纯度。DNA琼脂糖凝胶电泳:电泳缓冲液为0.5×TBE，DNA上样量:8μg.lane，以200bp marker作为对照组，75V、90min。紫外检测仪观察并电泳凝胶摄影分析。

    1.7 统计学方法 实验数据采用SPSS12.0统计软件进行统计分析。

　　2 结 果
    
　　2.1 CS对MCF-7细胞的生长抑制作用 见图1、图2。
 
　　图1 －图2 略
    
　　由图1、图2可见，CS在1.0μg.mL、24h对MCF-7就有抑制作用。随着浓度的增大和时间的延长，抑制作用明显增强，到达50μg.mL、96h后，CS浓度进一步增大，时间进一步延长时，仍有抑制作用，但增强趋势不明显，呈现微弱的平台期。说明CS在1.0～50μg.mL浓度情况下24～96h内对MCF-7有抑制作用，且呈药物剂量依赖性和时间依赖性。

　　2.2 流式细胞仪分析CS诱导细胞引流凋亡的作用 10、20、50μg.mL CS处理细胞后可见明显凋亡峰，其凋亡率分别为（4.9±3.2）%、（10.7±2.7）%、（14.7±0.5）%。对照组凋亡率为（0.9±0.2）%。其中20、50μg.mL CS处理细胞的凋亡率明显高于对照组（P<0.05）。
   
　　2.3 CS诱导MCF-7细胞DNA梯状条带形成 经20、50μg.mL CS处理的MCF-7细胞进行DNA琼脂糖凝胶电泳有典型梯形条带（ladder）出现。

　　3 讨 论
    
　　细胞凋亡（apoptosis，APO）是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主、有序的死亡，又称程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）。已有的研究表明，肿瘤的发生很可能就是由于细胞增殖和凋亡失调而导致肿瘤细胞无限无序增殖所致。所以，肿瘤细胞凋亡及其增殖抑制成为评估抗癌药物作用能力的重要指标。为此，本实验对CS诱导人乳癌细胞株MCF-7增殖抑制及凋亡作用进行了研究。

    本实验首先观察了CS对MCF-7细胞的增殖抑制作用，结果发现CS在较低的作用浓度（1.0μg.mL）就可以有效抑制MCF-7细胞的增殖，且在1.0～50μg.mL浓度范围内对MCF-7细胞的增殖抑制作用呈现浓度和时间依赖性，随着药物浓度和作用时间的增加，CS的抑制作用增强。流式细胞仪分析结果也显示，CS诱导MCF-7细胞凋亡，其凋亡率在一定范围内也具有随CS浓度增高而增高的趋势。10、20、50μg.mL CS处理MCF-7细胞后，凋亡率分别为（4.9±3.2）%、（10.7±2.7）%、（14.7±0.5）%。提取CS处理组细胞的DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，可呈现明显的DNA梯形条带，对照组则未出现梯形条带。这个结果与流式细胞仪的结果一致。本实验研究表明，CS通过某些尚不清楚的机制可诱导MCF-7细胞凋亡，这为今后在CS传统扶正培本治疗乳腺癌基础上，赋予其新的含义提供了一定的实验依据。

    近年来，许多学者从分子水平对中药诱导肿瘤细胞凋亡的机制进行了研究，但结果还不是很多，仅限于几个重要的基因，Bcl-2、C-myc、p53是几个了解较为深入的与凋亡调控有关的基因。现已证实，Bcl-2是最重要的抑制肿瘤细胞凋亡的基因［4～9］ ，CS是否是通过这一机制诱导MCF-7细胞凋亡，值得进一步深入研究。
    
　　参考文献
    
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　　作者简介:刘东颖（1974-），女，主治医师，硕士。从事肿瘤的中西医结合治疗和姑息治疗工作。
   
　　天津医科大学附属肿瘤医院中西医结合科，天津 300060