摘要：目的 分析重复序列引物聚合酶链反应(rep????PCR)的优化条件，并采用本方法分析本院呼吸科病房不同患者痰标本中分离到的产超广谱β内酰胺酶(ESBL)大肠杆菌是否起源于同一菌株。方法 用双纸片确定法测定是否产ESBL；用K????B法测定对抗生素的敏感程度；选用肠道菌广泛存在的基因间重复片断为引物进行扩增，并对实验条件进行优化；对产ESBL大肠艾希氏菌进行基因分型分析。结果 建立了rep????PCR法方法，显示可将大肠艾希氏菌扩增出丰富的区带。分离到的22株产ESBL大肠艾希氏菌分属3个基因型。结论 rep????PCR法可用于医院院内感染的流行病学调查。

　　关键词：大肠艾希氏菌；聚合酶链反应；流行病学

　　Preliminary application of rep????PCR in epidemiological research of　extended spetrum β????lactamase (ESBL)+ Escherichia coli

　　Ma Lieting, Yang Duo, Wang Yawen

　　(Department of Clinical Laboratory, The First Hospital of　Xian Jiaotong University, Xi????an 710061, China)
 
　　ABSTRACT: Objective  To establish better reaction factors for rep????PCR and to investigate if the extended spectrum β????lactamase (ESBL)+ Escherichia coli isolated from different patients in the respiratory ward have the same origin by using rep????PCR. Methods   The ESBL confirmation was taken by double disc confirmatory test. The susceptibility testing was performed with K????B test. By applying the widespread enterobacter repetitive intergenic consensus as a primer, the stains were typed by rep????PCR following electrophoresis in agarose gel. Results  The analysis of the PCR productions indicated that it would create useful DNA ban????prints and all these 22 ESBL(+)Escherichia coli strains were of three origins. Conclusion  The method of rep????PCR is practical for epidemiological research in nosocomial infection.

　　KEY WORDS: Escherichia coli; polymerase chain reaction; epidemiology

　　重复序列引物聚合酶链反应(rep????PCR)是在随机引物PCR(RAPD)基础上发展的对细菌DNA进行指纹图谱分析的一种新方法，它具有快速、经济、简便的优点，在医院感染菌株基因多态性分析中显示了巨大的优势\[1,2\]，但影响因素很多,需严格优化条件。为此，我们对我院呼吸科分离到的产ESBL大肠艾希氏菌进行rep????PCR基因分型，以探讨其在医院感染研究中的意义，同时对rep????PCR进行了优化，以期得出最佳反应条件。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株              

　　为2003年3月至7月从我院呼吸科病房不同患者痰标本中分离到的22株产ESBL大肠艾希氏菌。

　　1.1.2 主要仪器和试剂               

　　Taq DNA聚合酶,dNTPs,蛋白酶K，PCR扩增引物，由华美生物工程公司提供与合成；药敏纸片，鉴定纸片及培养基均购自英国Oxoid公司；生物梅里埃公司VITEK????TWO鉴定系统,美国PE公司PE5700型PCR扩增仪。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细菌鉴定              

　　采用生物梅里埃公司VITEK????TWO鉴定系统。

　　1.2.2 ESBL测定              

　　采用双纸片确定法及VITEK????TWO鉴定系统认定。

　　1.2.3 药敏实验              

　　采用KB法，并按NCCLS 2000标准处理和判断结果，并用质控菌ATCC25922监控。

　　1.2.4 DNA提取              

　　取3～4个孵育18～24h血平板上的纯培养菌落，悬于100μL蒸馏水中，95℃水浴15min，冰浴冷却，10000r/min离心20min，取上清-20℃保存备用。质量浓度约为40ng/μL。rep????PCR引物采用ERIC2 5′????AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC C????3′\[3,4\]。

　　1.2.5 电泳              

　　取PCR产物8μL，加2μL上样液，18g/L琼脂糖电泳1.5h(电压5V/cm)。判定标准：不管条带密度，凡条带数目与位置相同者为同一型。

　　2 结 果

　　2.1 产ESBL结果              

　　经双纸片确定法及VITEK????TWO鉴定系统认定，22株大肠艾希氏菌全部产ESBL。

　　2.2 rep????PCR结果

　　2.2.1   镁离子浓度对rep????PCR的影响              

　　在其他实验条件不变的情况下，改变镁离子浓度(1.5～6.0mmol/L)，发现大分子质量DNA片段随镁离子浓度的增加而增加，小分子质量DNA片段随镁离子浓度的增加而减少。而镁离子浓度在3.0～3.5mmol/L时大小片段均可获得较好的扩增。最终本实验镁离子浓度选择为3.0mmol/L。

　　2.2.2 引物浓度的选择              

　　实验显示在其他实验条件不变的情况下，改变引物浓度(10～50pmol/L)，在20～30pmol/L的范围内扩增效果最佳。

　　2.2.3 模板提取液的浓度              

　　模板浓度过高或过低均影响扩增效果，甚至可不出现扩增产物。实验显示模板提取液的量在2～3μL时指纹图结果一致，且分辨效果好。

　　综上结果，rep????PCR法对产ESBL大肠艾希氏菌分型的最佳条件为：反应体积为50μL，含引物1μmol/L, dNTP 200μmol/L, Mg2+ 3.0mmol/L，Taq酶2.5u, DNA模板2μL。反应循环条件：94℃预变性7min→(94℃变性30s→40℃退火3min→72℃延伸2min)，35个循环后→72℃延伸8min。

　　2.3 电泳结果              

　　以ERIC2为引物的rep????PCR将22株菌分为3个基因型(E1, E2, E3)；E1含8条带(1～8)，E2含7条带(9～15)，E3含7条带(16～22)，条带大小约为200～2500 bp(图1)。
　　
　　2.4 细菌耐药结果              

　　22株产ESBL大肠艾希氏菌对14种抗生素的耐药结果见表1。结果显示产ESBL大肠杆菌对三代头孢菌素高度耐药，并伴随有喹诺酮类及氨基糖甙的协同耐药。14种抗生素依次为：氨苄西林(AMP)、丁胺卡那(AKN)、头孢唑林(CFZ)、头孢他啶(CTD)、头孢噻肟(CTX)、头孢派酮(CFP)、环丙沙星(CIP)、庆大霉素(GEN)、亚胺培南(IMP)、诺氟沙星(NOR)、哌拉西林(PIP)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、阿莫西林/克拉维酸(AMC)、复方新诺明(SXT)。表1 22株产ESBL大肠艾希氏菌对14种抗菌药物的体外K????B法耐药情况和基因型（略）
                
　　3 讨 论

　　DNA随机扩增图谱分析在细菌流行病学研究领域已被广泛引用。该方法除具有常规PCR技术的快速、灵敏、简便等特点外，由于采用了通用引物，不必预先知晓该物种的基因序列，可用于不同细菌的快速流行病学调查，尤其是暴发流行的调查\[5,6\]，为及时控制感染争取了宝贵的时间。

　　在实际操作中，rep????PCR指纹图谱的清晰程度、条带的位置和数目以及实验的稳定性和重复性与所用引物的长度、序列和浓度、退火温度、镁离子浓度、模板浓度等诸多因素有关。实验发现，随着镁离子浓度的增加分子质量小的DNA片段被抑制，分子质量大的DNA片段被扩增。所以在对革兰氏阴性杆菌进行rep????PCR指纹图谱分析时，镁离子浓度应选择为3.0～3.5mmol/L，才可获得理想的扩增结果。另外，模板的量也会对扩增结果产生显著影响，为了实验的稳定性，每次抽提DNA后应测定含量，使模板浓度控制在30～50ng/μL。

　　产超广谱β内酰胺酶(ESBL)阴性杆菌所致的严重感染近年来已成为困扰临床治疗的严重问题，以往认为产ESBL菌的传播多由多重耐药质粒的转导引起，是耐药质粒在不同菌株间的传播，从而引起了多重耐药菌的暴发流行，但也不排除同一菌株在不同病患间的传播感染。本实验中，我们为了确定感染株是否是同一来源，对细菌进行了基因型的分析。回顾性调查发现，2003年3月至7月，我院呼吸科病房产ESBL大肠艾希氏菌分离率为56%，而同期其他病房产ESBL大肠艾希氏菌分离率<10%，呼吸科病房的产ESBL大肠艾希氏菌感染率明显高于其他科室，故高度怀疑有产ESBL大肠艾希氏菌的流行。通过rep????PCR的方法，本次实验的22株大肠艾希氏菌共来源于3个克隆株，证实了确有产ESBL大肠艾希氏菌在呼吸科病患间的传播感染。其感染的途径可能为病房环境，医护人员手，治疗器械等。我们同时发现，本次实验中22株大肠杆菌虽分为3个基因型，但各型中耐药谱却不完全相同，推测各菌耐药谱的不同可能与抗生素的诱导有关，其具体原因还有待进一步确认。

　　参考文献：

　　[1\]肖征，吴坚，杨继勇，等. 重复片段引物聚合酶链反应用于医院感染流行病学研究 \[J\]. 中华医学检验杂志, 1999, 22(4)232-234.

　　[2\]孙景勇，倪语星. 高度多重耐药绿脓假单胞菌的分子流行病学调查 \[J\]. 中华检验医学杂志, 2001, 24(3)165-167.

　　[3\]Speijer H, Savelkoul PHM, Bonten MJ, et al. Application of different genotyping methods for pseudomonas aeruginosa in a setting of endemicity in an intensive care unit \[J\]. J Clin Microbiol, 1999,37(11):3654-3661.

　　[4\]Grundmann HJ, Towner KJ, Dijkshoorn L, et al. Multicenter study using standardized protocols and reagents for evaluation of reproducibility of PCR????based fingerprinting of Acinetobacter spp \[J\]. J Clin Microbiol,1997,35(12):3071-3077.

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　　[6\]Amonsin A, Wellehan JFX, Li LL, et al. Molecular epidemiology of Ornitho bacterium rhinotracheale  \[J\]. J Clin Microbiol,1997,35(10):2894-2898.
                          
　　作者简介：马列婷(1965????)，女，(汉族)，医学硕士，副主任检验师，主要从事免疫学及微生物学检验研究.                             

　　(西安交通大学第一医院检验科，陕西西安710061)

　　(编辑卓选鹏)

　　收稿日期：2004????12????02